薄層色譜法實驗操作方法

薄層色譜法實驗流程

薄層色譜法系將供試品溶液點于薄層板上，在展開容器內用展開劑展開，使供試品所含成分分離，所得色譜圖與適宜的標準物質按同法所得的色譜圖對比，亦可用薄層色譜掃描儀進行掃描，用于鑒別、檢查或含量測定。

1.儀器與材料

（1）薄層板  按支持物的材質分為玻璃板、塑料板或鋁板等；按固定相種類分為硅膠薄層板、鍵合硅膠板、微晶纖維素薄層板、聚酰胺薄層板、氧化鋁薄層板等。固定相中可加入黏合劑、熒光劑。硅膠薄層板常用的有硅膠 G、硅膠 GF254、硅膠 H、硅膠 HF254，G、H 表示含或不含石膏黏合劑，F(xiàn)254 為在紫外光 254nm 波長到紫外線燈下顯綠色背景的熒光劑。按固定相粒徑大小分為普通薄層板（10~40μm）和高效薄層板（5~10μm）。

　　在保證色譜質量的前提下，可對薄層板進行特別處理和化學改性以適應分離的要求，可用實驗室自制的薄層板。固定相顆粒大小一般要求粒徑為 10~40μm。玻板應光滑、平整，洗凈后不附水珠。

　?。?）點樣器  一般釆用微升毛細管或手動、半自動、全自動點樣器材。

　　（3）展開容器  上行展開一般可用適合薄層板大小的專用平底或雙槽展開缸，展開時須能密閉。水平展開用專用的水平展開槽。

　?。?）顯色裝置  噴霧顯色應使用玻璃噴霧瓶或專用噴霧器，要求用壓縮氣體使顯色劑呈均勻細霧狀噴出；浸漬顯色可用專用玻璃器械或用適宜的展開缸代用；蒸氣熏蒸顯色可用雙槽展開缸或適宜大小的干燥器代替。

　?。?）檢視裝置  為裝有可見光、254nm 及 365nm 紫外光光源及相應的濾光片的紫外觀察箱，可附加攝像設備供拍攝圖像用。紫外觀察箱暗箱內光源應有足夠的光照度。

　?。?）薄層色譜掃描儀  系指用一定波長的光對薄層板上有吸收的斑點，或經(jīng)激發(fā)后能發(fā)射出熒光的斑點，進行掃描，將掃描得到的譜圖和積分數(shù)據(jù)用于物質定性或定量的分析儀器。

用于薄層色譜的紫外觀察箱、薄層分析用紫外線燈箱

薄層色譜法操作方法

　　（1）薄層板制備

　　市售薄層板  臨用前一般應在 110℃ 活化 30 分鐘。聚酰胺薄膜不需活化。鋁基片薄層板、塑料薄層板可根據(jù)需要剪裁，但須注意剪裁后的薄層板底邊的固定相層不得有破損。如在存放期間被空氣中雜質污染，使用前可用三氯甲烷、甲醇或二者的混合溶劑在展開缸中上行展開預洗，晾干，110℃ 活化，置干燥器中備用。

　　自制薄層板  除另有規(guī)定外，將 1 份固定相和 3 份水（或加有黏合劑的水溶液，如 0.2%~0.5%羥甲基纖維素鈉水溶液，或為規(guī)定濃度的改性劑溶液）在研缽中按同一方向研磨混合，去除表面的氣泡后，倒入涂布器中，在玻板上平穩(wěn)地移動涂布器進行涂布（厚度為 0.2~0.3mm），取下涂好薄層的玻板，置水平臺上于室溫下晾干后，在 110℃ 烘 30 分鐘，隨即置于有干燥劑的干燥箱中備用。使用前檢查其均勻度，在反射光及透視光下檢視，表面應均勻、平整、光滑，并且無麻點、無氣泡、無破損及污染。

　?。?）點樣  除另有規(guī)定外，在潔凈干燥的環(huán)境中，用專用毛細管或配合相應的半自動、自動點樣器械點樣于薄層板上。一般為圓點狀或窄細的條帶狀，點樣基線距底邊 10~15mm，高效板一般基線離底邊 8~10mm。圓點狀直徑一般不大于 4mm，高效板一般不大于 2mm。接觸點樣時注意勿損傷薄層表面。條帶狀寬度一般為 5~10mm，高效板條帶寬度一般為 4~8mm，可用專用半自動或自動點樣器械噴霧法點樣。點間距離可視斑點擴散情況以相鄰斑點互不干擾為宜，一般不少于 8mm，高效板供試品間隔不少于 5mm。

　?。?）展開  將點好供試品的薄層板放入展開缸中，浸入展開劑的深度為距原點 5mm 為宜，密閉。除另有規(guī)定外，一般上行展開 8~15cm，高效薄層板上行展開 5~8cm。溶劑前沿達到規(guī)定的展距，取出薄層板，晾干，待檢測。

　　展開前如需要溶劑蒸氣預平衡，可在展開缸中加入適量的展開劑，密閉，一般保持 15~30 分鐘。溶劑蒸氣預平衡后，應迅速放入載有供試品的薄層板，立即密閉，展開。如需使展開缸達到溶劑蒸氣飽和的狀態(tài)，則須在展開缸的內壁貼與展開缸高、寬同樣大小的濾紙，一端浸入展開劑中，密閉一定時間，使溶劑蒸氣達到飽和再如法展開。

　　必要時，可進行二次展開或雙向展開，進行第二次展開前，應使薄層板殘留的展開劑完全揮干。

　?。?）顯色與檢視  有顏色的物質可在可見光下直接檢視，無色物質可用噴霧法或浸漬法以適宜的顯色劑顯色，或加熱顯色，在可見光下檢視。有熒光的物質或顯色后可激發(fā)產(chǎn)生熒光的物質可在紫外線燈（365nm 或 254nm）下觀察熒光斑點。對于在紫外光下有吸收的成分，可用帶有熒光劑的薄層板（如硅膠 GF254 板），在紫外光燈（254nm）下觀察熒光板面上的熒光物質淬滅形成的斑點。

　?。?）記錄  薄層色譜圖像一般可采用攝像設備拍攝，以光學照片或電子圖像的形式保存。也可用薄層色譜掃描儀掃描或其他適宜的方式記錄相應的色譜圖。

　　3.系統(tǒng)適用性試驗

　　按各品種項下要求對實驗條件進行系統(tǒng)適用性試驗，即用供試品和標準物質對實驗條件進行試驗和調整，應符合規(guī)定的要求。

　?。?）比移值（Rf）  系指從基線至展開斑點中心的距離與從基線至展開劑前沿的距離的比值。

　　除另有規(guī)定外，雜質檢查時，各雜質斑點的比移值 Rf 以在 0.2~0.8 之間為宜。

　?。?）檢出限  系指限量檢查或雜質檢查時，供試品溶液中被測物質能被檢出的低濃度或量。一般采用已知濃度的供試品溶液或對照標準溶液，與稀釋若干倍的自身對照標準溶液在規(guī)定的色譜條件下，在同一薄層板上點樣、展開、檢視，后者顯清晰可辨斑點的濃度或量作為檢出限。

　?。?）分離度（或稱分離效能）  鑒別時，供試品與標準物質色譜中的斑點均應清晰分離。當薄層色譜掃描法用于限量檢查和含量測定時，要求定量峰與相鄰峰之間有較好的分離度，分離度(R)的計算公式為：

　　R=2(d2-d1)/(W1+W2)

　　式中 d2 為相鄰兩峰中后一峰與原點的距離；

　　d1 為相鄰兩峰中前一峰與原點的距離；

　　W1 及 W2 為相鄰兩峰各自的峰寬。

　　除另有規(guī)定外，分離度應大于 1.0。

　　在化學藥品雜質檢查的方法選擇時，可將雜質對照品用供試品自身稀釋的對照溶液溶解制成混合對照溶液，也可將雜質對照品用待測組分的對照品溶液溶解制成混合對照標準溶液，還可釆用供試品以適當?shù)慕到夥椒ǐ@得的溶液，上述溶液點樣展開后的色譜圖中，應顯示清晰分離的斑點。

　?。?）相對標準偏差  薄層掃描含量測定時，同一供試品溶液在同一薄層板上平行點樣的待測成分的峰面積測量值的相對標準偏差應不大于 5.0%；需顯色后測定的或者異板的相對標準偏差應不大于 10.0%。

　　4.測定法

　　（1）鑒別  按各品種項下規(guī)定的方法，制備供試品溶液和對照標準溶液，在同一薄層板上點樣、展開與檢視，供試品色譜圖中所顯斑點的位置和顏色（或熒光）應與標準物質色譜圖的斑點一致。必要時化學藥品可采用供試品溶液與標準溶液混合點樣、展開，與標準物質相應斑點應為單一、緊密斑點。

　?。?）限量檢查與雜質檢查  按各品種項下規(guī)定的方法，制備供試品溶液和對照標準溶液，并按規(guī)定的色譜條件點樣、展開和檢視。供試品溶液色譜圖中待檢查的斑點與相應的標準物質斑點比較，顏色（或熒光）不得更深；或照薄層色譜掃描法操作，測定峰面積值，供試品色譜圖中相應斑點的峰面積值不得大于標準物質的峰面積值。含量限度檢查應按規(guī)定測定限量。

　　化學藥品雜質檢查可釆用雜質對照法、供試品溶液的自身稀釋對照法或兩法并用。供試品溶液除主斑點外的其他斑點與相應的雜質對照標準溶液或系列濃度雜質對照標準溶液的相應主斑點比較，不得更深，或與供試品溶液自身稀釋對照溶液或系列濃度自身稀釋對照溶液的相應主斑點比較，不得更深。通常應規(guī)定雜質的斑點數(shù)和單一雜質量，當釆用系列自身稀釋對照溶液時，也可規(guī)定估計的雜質總量。

　?。?）含量測定  照薄層色譜掃描法，按各品種項下規(guī)定的方法，制備供試品溶液和對照標準溶液，并按規(guī)定的色譜條件點樣、展開、掃描測定?；驅⒋郎y色譜斑點刮下經(jīng)洗脫后，再用適宜的方法測定。

5.薄層色譜掃描法

　　系指用一定波長的光照射在薄層板上，對薄層色譜中可吸收紫外光或可見光的斑點，或經(jīng)激發(fā)后能發(fā)射出熒光的斑點進行掃描，將掃描得到的圖譜及積分數(shù)據(jù)用于鑒別、檢查或含量測定。可根據(jù)不同薄層色譜掃描儀的結構特點，按照規(guī)定方式掃描測定，一般選擇反射方式，采用吸收法或熒光法。除另有規(guī)定外，含量測定應使用市售薄層板。

　　掃描方法可采用單波長掃描或雙波長掃描。如采用雙波長掃描，應選用待測斑點無吸收或小吸收的波長為參比波長，供試品色譜圖中待測斑點的比移值（Rf 值）、光譜掃描得到的吸收光譜圖或測得的光譜大吸收和小吸收應與對照標準溶液相符，以保證測定結果的準確性。薄層色譜掃描定量測定應保證供試品斑點的量在線性范圍內，必要時可適當調整供試品溶液的點樣量，供試品與標準物質同板點樣、展開、掃描、測定和計算。

　　薄層色譜掃描用于含量測定時，通常采用線性回歸二點法計算，如線性范圍很窄時，可用多點法校正多項式回歸計算。供試品溶液和對照標準溶液應交叉點于同一薄層板上，供試品點樣不得少于 2 個，標準物質每一濃度不得少于 2 個。掃描時，應沿展開方向掃描，不可橫向掃描。

上圖：用于薄層色譜的雙波長紫外線燈LEAC-280L