熒光顯微鏡的原理使用方法和注意事項

熒光顯微鏡工作原理

多采用200W的超高壓汞燈作光源，它是用石英玻璃制作，中間呈球形，內(nèi)充一定數(shù)量的汞，工作時由兩個電極間放電，引起水銀蒸發(fā)，球內(nèi)氣壓迅速升高，當水銀完全蒸發(fā)時，可達50～70個標準大氣壓力，這一過程一般約需5～15min。超高壓汞燈的發(fā)光是電極間放電使水銀分子不斷解離和還原過程中發(fā)射光量子的結(jié)果。它發(fā)射很強的紫外和藍紫光，足以激發(fā)各類熒光物質(zhì)，因此，為熒光顯微鏡普遍采用。

1．激發(fā)濾板根據(jù)光源和熒光色素的特點，可選用以下三類激發(fā)濾板，提供一定波長范圍的激發(fā)光。
紫外光激發(fā)濾板：此濾板可使400nm以下的紫外光透過，阻擋400nm以上的可見光通過。常用型號為UG-1或UG-5，外加一塊BG-38，以除去紅色尾波。
紫外藍光激發(fā)濾板：此濾板可使300～450nm范圍內(nèi)的光通過。常用型號為ZB-2或ZB-3，外加BG-38。
紫藍光激發(fā)濾板：它可使350～490nm的光通過。常用型號為QB24（BG12）。
zui大吸收峰在500nm以上者的熒光素（如羅達明色素）可用藍綠濾板（如B-7）激發(fā)。

熒光顯微鏡和普通顯微鏡的區(qū)別

熒光顯微鏡是利用紫外線為光源，用以照射被檢驗的物體，使該物體發(fā)出光源，然后在顯微鏡下進行對物體的觀察。主要是用于免疫熒光細胞，主要是由光源、濾板系統(tǒng)和光學(xué)系統(tǒng)組成的在通過目鏡和物鏡的放大來觀察樣本的熒光圖像。我們來看下這熒光顯微鏡和普通光學(xué)顯微鏡有什么樣的區(qū)別。
1、在照明方式上看
熒光顯微鏡的照明方式一般是用落射式，也就是說光源是通過物鏡來投放于試驗樣本上。

2、在分辨率上看
熒光顯微鏡利用的是紫外線做為光源，波長比較短，但是分辨率卻高于普通的光學(xué)顯微鏡。
3、在濾光片上的不同
熒光顯微鏡是用了兩個特殊的濾光片，在光源前用是用來濾出可見光，在物鏡和目鏡之間的使用來濾出紫外線，這樣可以保護人的眼睛。
熒光顯微鏡也屬于光學(xué)顯微鏡的一種，主要是銀光顯微鏡所激發(fā)的波長短，所以這才導(dǎo)致了熒光顯微鏡和普通顯微鏡雜結(jié)構(gòu)構(gòu)造和使用上的不同，熒光顯微鏡大都有良好的捕捉弱光的功能，所以在極其微弱的熒光下，它的成像能力也和好。再加上近年來對熒光顯微鏡的不斷改善，噪音也大幅度降低。因此越來越多的熒光顯微鏡得到應(yīng)用。
以上是關(guān)于熒光顯微鏡和普通光學(xué)顯微鏡的區(qū)別，了解這些以后，在鑒別是不是熒光顯微鏡會有很大的幫助。

熒光顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡區(qū)別及特性
熒光顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡不同，它不是通過普通光源的照明觀察標本，而是利用定波長的光(通常是紫外光、藍紫光)激發(fā)顯微鏡下標本內(nèi)的熒光物質(zhì)，使之發(fā)射熒光，所以，熒光顯微鏡的光源所起的作用不是直接照明，而是作為種激發(fā)標本的內(nèi)熒光物質(zhì)的能源。我們之所以能觀察標本，不是由于光源的照明，而是標本內(nèi)熒光物質(zhì)吸收激發(fā)的光能后所呈現(xiàn)的熒光現(xiàn)象。由此可知，熒光顯微鏡的特點，主要是它的光源能供給大量特定波長范圍的激發(fā)光，使受檢標本內(nèi)的熒光物質(zhì)能獲得必要強度的激發(fā)光。同時，熒光顯微鏡必須具備相應(yīng)的濾光鏡系統(tǒng)。熒光顯微鏡是**熒光組織化學(xué)的基本工具。它是由超壓光源、濾片系統(tǒng)(包括激發(fā)和壓制濾板)、光學(xué)系統(tǒng)和攝影系統(tǒng)等主要部件組成，是利用定波長的光激發(fā)標本發(fā)射熒光。
1.激發(fā)熒光的方式：按光的波長范圍分為UV激發(fā)法(使用紫外線照明法)和BV激發(fā)法(使用藍紫光)兩種。UV激發(fā)法是用短于400nm的近紫外光進行激發(fā)。該法不存在可見的激發(fā)光，所以被觀察的熒光呈現(xiàn)該染料固有的熒光，容易判別標本上的特異熒光和背景組織的自身熒光。
2.BV激發(fā)法：是以404nm、434nm為中心的由紫外至藍光進行激發(fā)。該方法使用藍光照射標本，所以熒光觀察系統(tǒng)的截止濾光片必須使用可完全阻斷藍光并可充分通過所需綠、黃熒光的濾光片。用于熒光抗體法的熒光色素。對于激發(fā)光的大吸收波長和熒光的大發(fā)光波長比較接近，所以BV激發(fā)法使用的濾光片必須使用銳截止式濾光片。該法可用藍光作為激發(fā)光，所以熒光色素的吸收效率較，可得到較明亮的圖像。其缺點是500nm以下的熒光無法看到，而500nm以上的使整個圖像顯黃色。在熒光抗體法中，大多以熒光色素特有的顏色來判斷其特異性，所以在討論微妙的特異性時，上述BV激發(fā)法的缺點往往影響大。

熒光顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡光源的區(qū)別
熒光顯微鏡的光源主要采用氙弧燈或汞燈，但近年來也使用高功率LED作光源，而普通光學(xué)顯微鏡通常只有鹵素或LED燈來照明。熒光顯微鏡的照明方式一般是用落射式，也就是說光源是通過物鏡來投放于試驗樣本上，而普通光學(xué)顯微鏡是直接用光源照射樣品，從而進行的觀察。在分辨率上講，熒光顯微鏡利用的是紫外線光源，波長比較短，但是分辨率卻高于普通的光學(xué)顯微鏡。在濾光片的使用上，熒光顯微鏡是用了兩個特殊的濾光片，在光源前的作用是用來濾出可見光，在物鏡和目鏡之間的作用是用來濾出紫外線，以保護觀察者的眼睛。熒光顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡的區(qū)別大致就是這些。

熒光顯微鏡使用方法

1、用窗簾遮蔽光線，關(guān)閉房間內(nèi)的電燈，除去熒光顯微鏡的防塵罩，確保熒光顯微鏡燈室通風(fēng)良好、無遮蓋。裝上汞燈燈箱，并轉(zhuǎn)動燈箱卡圈上的撥桿，將燈箱與鏡臂連接。
2、將汞燈燈箱的電源插頭插入熒光電源箱后的插座，再將熒光電源箱的插頭插入220V外接電源。
3、打開熒光顯微鏡電源開關(guān)，電壓表顯示出電源電壓，如電源電壓波動不大于額定電壓值的5%，即可按下啟動開關(guān)點燃汞燈，如因天氣太冷或電壓不穩(wěn)定等原因，一次啟動未點燃汞燈，可以多按幾次。待超高壓汞燈弧光達到穩(wěn)定狀態(tài)并達到Zda發(fā)光效率，即可開始工作。
4、燈泡的使用調(diào)中：
①任選一塊標本放在熒光顯微鏡載物臺上。
 ②轉(zhuǎn)動鏡臂上的聚光鏡旋鈕使聚光鏡移出光路，轉(zhuǎn)動濾色片組轉(zhuǎn)換手輪，將紫光(V)或藍光(B)或綠光(G)激發(fā)濾色片組轉(zhuǎn)入光路，并將25熒光物鏡轉(zhuǎn)入光路。
③調(diào)節(jié)粗微調(diào)手輪，將標本像調(diào)焦清晰。
④前后推動垂直照明器右邊的聚光鏡調(diào)焦推桿，使視場光欄成像清晰，轉(zhuǎn)動視場光欄撥桿將視場光欄收小，調(diào)節(jié)視場光欄調(diào)中螺釘使視場光欄居中，然后再將視場光欄開至Zda。
⑤轉(zhuǎn)動鏡臂上的聚光鏡旋鈕使聚光鏡移入光路，前后調(diào)節(jié)燈箱上的聚光鏡撥桿，使汞燈的弧光在視場內(nèi)成像清晰。
⑥調(diào)整燈箱上的燈泡水平調(diào)節(jié)螺釘和垂直調(diào)節(jié)螺釘，使汞燈的弧光居中。
⑦調(diào)整反光鏡水平調(diào)節(jié)螺釘和垂直調(diào)節(jié)螺釘，使光源的反射像與汞燈的弧光分開。
⑧轉(zhuǎn)動聚光鏡旋鈕把聚光鏡移出光路，此時視場照明均勻。
5、熒光顯微鏡使用過程中熒光觀察：
①將熒光染色標本放到熒光顯微鏡載物臺上。
②將10x平場物鏡或25x熒光物鏡轉(zhuǎn)入光路，調(diào)節(jié)載物臺縱橫移動手輪，將標本移入光路。
③轉(zhuǎn)動濾光片轉(zhuǎn)換撥輪，將熒光染色標本所需要的激發(fā)濾光片組轉(zhuǎn)入光路。激發(fā)濾光片組編號刻在濾片組轉(zhuǎn)換撥輪上。濾光片選擇正確與否，是熒光顯微鏡能否得到正確應(yīng)用的關(guān)鍵。選用濾光片時，必須遵守斯托克斯定律：激發(fā)濾光片的透射波長<雙色束分離器的透射波長<阻斷濾光片的透射波長。
④調(diào)節(jié)粗調(diào)手輪，當看清熒光圖像輪廓后，再用微調(diào)手輪調(diào)焦，直至看到清晰的熒光圖像。
⑤當需要得到較強的熒光圖像時，可轉(zhuǎn)動聚光鏡旋鈕把聚光鏡移入光路，可獲得較明亮的熒光圖像。
⑥當需要使用40x或100x熒光物鏡觀察時，應(yīng)在標本和物鏡間加上甘油，油中不能有影響觀察的小泡或雜質(zhì)。使用時可使甘油慢慢浸潤一會兒，然后輕輕左右來回轉(zhuǎn)動物鏡轉(zhuǎn)換器以排除氣泡。

6、熒光顯微攝影
由于熒光圖像一般均較明場觀察暗得多，所以進行熒光顯微攝影需要較長的曝光時間，在曝光時應(yīng)注意避免熒光顯微鏡震動。為了縮短曝光時間，可選擇倍率較低的攝影目鏡或感光度較高的攝影膠片如ASA200以上或DIN24以上。
熒光顯微鏡攝影技術(shù)對于記錄熒光圖像十分必要，由于熒光很易褪色減弱，要即時攝影記錄結(jié)果。方法與普通顯微攝影技術(shù)基本相同。因紫外光對熒光猝滅作用大，如FITC的標記物，在紫外光下照射30s，熒光亮度降低50%。所以，曝光速度太慢，就不能將熒光圖像拍攝下來。一般研究型熒光顯微鏡都有半自動或全自動顯微攝影系統(tǒng)裝置。

7、熒光圖像的記錄方法
熒光顯微鏡所看到的熒光圖像，一是具有形態(tài)學(xué)特征，二是具有熒光的顏色和亮度，在判斷結(jié)果時，必須將二者結(jié)合起來綜合判斷。結(jié)果記錄根據(jù)主觀指標，即憑工作者目力觀察。作為一般定性觀察，基本上是可靠的。
8、熒光顯微鏡使用結(jié)束，關(guān)閉電源，做好鏡頭和載物臺的清潔工作，待燈室冷卻至室溫后，用防塵罩蓋好顯微鏡，并做好使用記錄。

熒光顯微鏡使用步驟

1.關(guān)閉房間內(nèi)的電燈，開啟顯微鏡汞燈；
2.根據(jù)樣品標記的熒光素選擇相應(yīng)的濾光片；
3.放好樣品，找到合適的視野；
4.如需拍照，請確認照相機內(nèi)已裝好彩色膠卷（zui好使用27定膠卷）；
5.開啟自拍裝置，選擇手動檔，通常拍攝速度在0.5-10秒內(nèi)；
6.使用結(jié)束，關(guān)閉電源并做好使用記錄。

熒光顯微鏡使用注意事項

1、嚴格按照熒光顯微鏡說明書要求進行操作，不要隨意改變程序。
2、熒光顯微鏡應(yīng)在暗室中進行檢查。進入暗室后，接上電源，點燃超高壓汞燈5～15min，待光源發(fā)出強光穩(wěn)定后，眼睛完全適應(yīng)暗室，再開始觀察標本。
3、防止紫外線對眼睛的損害，在調(diào)整光源時應(yīng)戴上防護眼鏡。
4、檢查時間每次以1～2h為宜，超過90min，超高壓汞燈發(fā)光強度逐漸下降，熒光減弱;標本受紫外線照射3～5min后，熒光也明顯減弱;所以，Z多不得超過2～3h。
5、熒光顯微鏡光源壽命有限，標本應(yīng)集中檢查，以節(jié)省時間，保護光源。天熱時，應(yīng)加電扇散熱降溫，新?lián)Q燈泡應(yīng)從開始就記錄使用時間。燈熄滅后欲再用時，須待燈泡充分冷卻后才能點燃。中應(yīng)避免數(shù)次點燃光源。
6、標本染色后立即觀察，因時間久了熒光會逐漸減弱。若將標本放在聚乙烯塑料袋中保存，可延緩熒光減弱時間，防止封裱劑蒸發(fā)。
7、熒光亮度的判斷標準：一般分為四級，即“-”表示無或可見微弱熒光?！?”表示僅能見明確可見的熒光?！?+”表示可見有明亮的熒光。“+++”表示可見耀眼的熒光。
8、其它注意事項、熒光顯微鏡所看到的熒光圖像，一是具有形態(tài)學(xué)特征，二是具有熒光的顏色和亮度，在判斷結(jié)果時，必須將二者結(jié)合起來綜合判斷。熒光顯微鏡攝影技術(shù)對于記錄熒光圖像十分必要，由于熒光很易褪色減弱，要即時攝影記錄結(jié)果。