熒光蛋白是如何發(fā)光的嗎?
熒光蛋白(FPs)于50多年前被發(fā)現(xiàn),當時發(fā)現(xiàn)了綠色熒光蛋白(GFP),這是一種來自維多利亞水母的蛋白質。自從發(fā)現(xiàn)以來,熒光蛋白家族不斷擴大,有數(shù)百種變體可用。請繼續(xù)閱讀,以熟悉可用的FP發(fā)射顏色,并在為即將到來的實驗選擇熒光蛋白(或兩個)時記住10點。
熒光是吸收光的物質發(fā)射的光。發(fā)射的光的波長比激發(fā)波長長。因此,F(xiàn)Ps是具有這種獨特能力的蛋白質。
當在大多數(shù)生物體中異位表達時,許多這些FP是熒光的。此外,將FP融合到另一種蛋白質通常不會影響其熒光。因此,F(xiàn)P用于研究許多生物學問題。兩個zui常見的用途是:1)測試特定系統(tǒng)中的表達水平(通過測量熒光強度);2)可視化FP的定位(融合到感興趣的蛋白質),從而跟蹤活細胞內生物分子的定位。
熒光蛋白按發(fā)射顏色(發(fā)射波長范圍)分類
熒光蛋白通常按發(fā)射顏色分類,如下所述(或發(fā)射波長范圍)。通過突變GFP,衍生了藍色FP(BFP),青色FP(CFP)和黃色FP(YFP)的變體。有關GFP的細分,它是變體及其相關突變,請查看Marcy上周在GFP上的帖子。此外,在其他生物體中還發(fā)現(xiàn)了許多其他FP。
藍:424 - 467 nm
青色: 474 - 492 nm
綠: 499 - 519 nm
黃色: 524 - 538 nm
橙: 559 - 572 nm
紅: 574 - 610 nm
遠紅: 625 - 659 nm
紅外線: ≥ 670 nm
獨特的熒光蛋白類別
光活性/光轉換:當這些蛋白質被特定的激發(fā)波長激活時,它們可以改變它們的顏色。這意味著發(fā)射波長可以改變。在少數(shù)情況下,蛋白質的初始狀態(tài)是非熒光的,因此允許非常低的背景水平的熒光。這種光可解或光可轉換蛋白質的例子是PA-GFP,Dendra2和meEOS蛋白。一些蛋白質是可逆可切換的(例如rsEGFP,Dreiklang)。
熒光定時器(FT):這些蛋白質會隨時間改變其顏色。因此,這些可以用作激活后細胞過程的“計時器”。四個主要的FT稱為慢FT,中FT,F(xiàn)ast-FT和mK-GO。
大斯托克斯位移(LSS):斯托克斯位移(以George G. Stokes命名)是波長從激發(fā)到發(fā)射的轉變。對于大多數(shù)FP,斯托克斯位移小于50nm(通常要小得多)。對于LSS蛋白,斯托克斯位移≥100nm。具體來說,這些蛋白質被紫外線或藍光激發(fā),它們的發(fā)射是綠光或紅光。例如,T-Sapphire、LSSmOrange 和 LSSmKate。
熒光傳感器:這些FP會根據環(huán)境變化(例如pH,Ca)改變其激發(fā)/發(fā)射行為2+助焊劑等)。zui常用的是GECI - 遺傳編碼的鈣指示劑(例如GCaMP)。其他包括:pHluorin & pHTomato(pH傳感器),HyPer(H2O2傳感器)、ArcLight(電壓傳感器)和 iGluSnFr(谷氨酸傳感器)。這些生物傳感器的更多例子可以在Addgene上找到。
分裂FP - 一些FP(例如GFP,Venus)可以分成兩半,它們本身是非熒光的。如果兩半非常接近,它們將形成完整的FP和熒光。分裂FP可用于確定融合到分裂FP一半的兩種蛋白質的接近程度。這種技術也被稱為雙分子熒光互補(BiFC)。
選擇熒光蛋白時要記住的8點
激勵和發(fā)射(ex/em):
每個熒光蛋白都有其獨特的ex/em峰值。因此,請選擇系統(tǒng)可以激發(fā)的熒光蛋白,并檢測發(fā)射。例如,如果您的顯微鏡只有兩個激光器,分別為488nm和561nm,您將無法使用遠紅熒光蛋白。如果您沒有將藍光傳遞到探測器/相機的過濾器,那么BFP對您毫無用處。
當使用多個熒光蛋白時,請確保它們的發(fā)射光在波長上不重疊。在許多顯微鏡中,濾光片不夠窄,無法區(qū)分密切相關的顏色。此外,大多數(shù)FP具有廣泛的發(fā)射范圍,可以通過更長波長的濾光片檢測到(例如,GFP也發(fā)出黃光)。
請注意,F(xiàn)Ps的某些組合會導致稱為FRET(熒光[或F?rster]共振能量轉移)的效應。當來自一個FP(例如CFP)的能量轉移激發(fā)另一個FP(例如YFP)的熒光時,就會發(fā)生FRET。FRET僅在兩個FP之間的距離<10nm時發(fā)生,并且在標記相互作用的蛋白質時應考慮。事實上,F(xiàn)RET通常用于確定兩種蛋白質是否相互作用。
齊聚:代FP容易寡聚。這可能會影響FP融合蛋白的生物學功能。因此,建議使用單體FP(通常用“m”表示為蛋白質名稱中的個字母,例如mCherry)。
氧:發(fā)色團在許多FP(特別是來自GFP的FP)上的成熟需要氧氣。因此,這些FP不能在缺氧環(huán)境中使用。zui近,從鰻魚中分離出的一種新的GFP被證明可以獨立于氧氣成熟,適合在厭氧條件下使用。
成熟時間:成熟時間是FP正確折疊并產生發(fā)色團所需的時間。這可以從翻譯后的幾分鐘到幾個小時。例如,超級文件夾GFP(sfGFP)和mNeonGFP可以在37°C下折疊<10分鐘,mCherry需要約15分鐘,TagRFP?100分鐘和DsRed?10小時。
溫度:FPs成熟時間和熒光強度會受到溫度的影響。例如,增強型GFP(EGFP)針對37°C進行了優(yōu)化,因此zui適合哺乳動物或細菌研究,而GFP不銹鋼更適合酵母研究(24-30°C)。
亮度:亮度是衡量發(fā)射亮度的指標。亮度計算為蛋白質的消光系數(shù)和量子產率除以1000的乘積。在許多情況下,亮度與EGFP的亮度進行比較,EGFP設置為1。一些蛋白質非常暗淡(例如TagRFP657,其亮度為0.1),應考慮到這一點。光穩(wěn)定性會受到實驗參數(shù)(例如激發(fā)光強度、pH 或溫度)的影響。
光:熒光分子在長時間暴露于激發(fā)光后被漂白(即失去發(fā)光的能力)。光穩(wěn)定性可以短至100ms(EBFP)或長達1小時(mAmetrine1.2)。但是,對于大多數(shù)FP,它是幾秒鐘到幾分鐘。光穩(wěn)定性可能受實驗參數(shù)(例如激發(fā)光強度、pH 值或溫度)的影響。
pH 穩(wěn)定性:如果您計劃在酸性環(huán)境中表達FP(例如,微酸性酵母細胞質基質或突觸囊泡),則此參數(shù)很重要。一些FP具有不同的ex/em光譜(例如mKeima)或隨著pH值的變化而改變熒光強度(例如pHluorin,pHTomato)。
為什么選擇綠色熒光蛋白?
GFP是一種約27 kDa的蛋白質,由來自維多利亞水母的238個氨基酸組成。它在可見光譜的綠色部分具有熒光發(fā)射波長(因此得名),這是由于由蛋白質中心(Ser65,Tyr66和Gly67)的三個特定氨基酸的成熟反應形成的發(fā)色團。當被發(fā)現(xiàn)時,GFPzui令人驚訝的方面之一是發(fā)色團自發(fā)形成,沒有額外的輔助因子,底物或酶活性 - 它只需要在成熟過程中存在氧氣。這意味著蛋白質可以直接從維多利亞甲殼蟲中獲取,并在任何生物體中表達,同時仍然保持熒光。
蛋白質結構于1996年報道,是一種含有11 β片的“桶”形狀,發(fā)色團隱藏在結構的中心,不受水溶劑的淬火。這種緊密排列的結構解釋了整個GFP蛋白的重要性,這幾乎完全是維持熒光活性所必需的;截斷是可以容忍的,但是,點突變是可以接受的。與當時的傳統(tǒng)熒光染料相比,GFP的主要優(yōu)勢在于它是無毒的,可以在活細胞中表達,從而能夠研究動態(tài)的生理過程。