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PMA光解儀在活菌檢測(cè)中的應(yīng)用

作者:上海峰志 時(shí)間:2022-12-30 13:19:15瀏覽1159 次

信息摘要:

PMA是一種光敏反應(yīng)染料,它對(duì)DNA具有非常高的親和力。當(dāng)細(xì)胞膜處于不完整狀態(tài)或者細(xì)胞已經(jīng)死亡,細(xì)胞膜對(duì)外界的物質(zhì)的進(jìn)出就沒有了選擇性,PMA就可以順利進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),與DNA進(jìn)行結(jié)合,在光照作用下發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)。

PMA光解儀在活菌檢測(cè)中的應(yīng)用 

PMA是一種高親和性的DNA結(jié)合染料,尤其與雙鏈DNA,該染料本身具有微弱的熒光,但與核酸結(jié)合后可以發(fā)出更為明亮的熒光。PMA具有細(xì)胞膜不可滲透性,因此可選擇性地修飾膜受損的死細(xì)胞的DNA。PMA修飾的DNA經(jīng)LUYOR-3419PMA光解儀藍(lán)光(~464 nm)光解后,PMA上的光反應(yīng)性疊氮基轉(zhuǎn)化為高反應(yīng)性氮烯自由基,與DNA結(jié)合位點(diǎn)附近的任何烴部分反應(yīng)形成穩(wěn)定的共價(jià)氮碳鍵,從而導(dǎo)致性DNA 修飾。該修飾過程會(huì)使DNA不溶,且在后期的基因組DNA提取過程中與細(xì)胞碎片一起丟失。殘留在溶液中未結(jié)合的PMA,在強(qiáng)光照射下與水分子反應(yīng)分解成無(wú)交聯(lián)活性的羥胺化合物,使其不能再共價(jià)結(jié)合DNA?;赑MA的這一特性,我司將PMA與qPCR技術(shù)相結(jié)合,形成一種新的檢測(cè)方法—PMA-qPCR,用于活細(xì)菌的篩選。目前該法已在多種細(xì)菌菌株以及酵母、真菌、病毒和寄生蟲中得到驗(yàn)證。

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復(fù)雜樣品的處理,如糞便或土壤,可能會(huì)需要優(yōu)化樣品稀釋度、染料濃度和光處理時(shí)間。稀釋樣品的處理,如水測(cè)試,可能需要在染料處理前進(jìn)行過濾或濃縮。

疊氮溴化丙錠的介紹 

疊氮溴化丙錠(?PMA)是一種光敏反應(yīng)染料,它對(duì)DNA具有非常高的親和力。當(dāng)細(xì)胞膜處于不完整狀態(tài)或者細(xì)胞已經(jīng)死亡,細(xì)胞膜對(duì)外界的物質(zhì)的進(jìn)出就沒有了選擇性,PMA就可以順利進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),與DNA進(jìn)行結(jié)合,在LUYOR-3419PMA光解儀光照作用下發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)。交聯(lián)后的DNA就不能作為模板進(jìn)行擴(kuò)增,殘留在溶液中的未被結(jié)合的PMA在光照下與水分子形成羥胺化合物,從而阻止其與在提取過程中活菌產(chǎn)生的DNA結(jié)合,影響檢測(cè)結(jié)果。而對(duì)于活的細(xì)胞而言,細(xì)胞膜具有選擇性,PMA便不能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)。將PMA這種特性與熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行偶聯(lián),便可以實(shí)現(xiàn)對(duì)活菌的檢測(cè)。 

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影響活菌檢測(cè)的因素 

采集的樣品 

PMA偶聯(lián)熒光PCR技術(shù)對(duì)樣品的要求比較高。有研究發(fā)現(xiàn),環(huán)境中的樣品,食品樣品和臨床上的病料中常常含有一些無(wú)機(jī)物質(zhì).有機(jī)物質(zhì)。這些物質(zhì)的存在既可以降低PMA的有效濃度,也可以干擾PMA與核酸的交聯(lián)反應(yīng)。詳細(xì)的說,樣品中的無(wú)機(jī)物和有機(jī)物會(huì)造成樣品的濁度提高,樣品越渾濁,光的透過性就越差,越影響PMA與樣品在光照條件下的交聯(lián)反應(yīng)。為了避免和減少因樣品采集帶來(lái)的誤差,Luo等人在一項(xiàng)研究中提出,要嚴(yán)格規(guī)范濁度的閾值,這樣對(duì)每一份樣品檢測(cè)具有更重要的意義和參考價(jià)值。有研究表明,當(dāng)樣品的濁度達(dá)到10個(gè)散射濁度單位的時(shí)候,樣品的濁度對(duì)于PMA交聯(lián)DNA是沒有影響的。當(dāng)樣品的濁度高于10個(gè)散射濁度時(shí),樣品的濁度對(duì)于PMA交聯(lián)DNA具有非常大的影響。 

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PMA與DNA作用階段 

PMA與DNA作用階段主要是指PMA進(jìn)入細(xì)胞膜受損傷的過程和PMA結(jié)合DNA的過程。PMA是一種對(duì)光較為敏感的染料,即便在普通光源下,也能降低PMA的有效濃度。因此,在PMA與細(xì)胞核DNA作用的過程中要避光。在這個(gè)過程中,PMA的濃度、PMA與核酸的作用時(shí)間,溫度等都會(huì)影響終的檢測(cè)結(jié)果。有些學(xué)者在參考別的研究者活菌檢測(cè)技術(shù)時(shí),設(shè)置了同樣的溫度、濃度和時(shí)間,但是結(jié)果卻不甚理想。其主要原因是樣品不同,佳的PMA的濃度和作用時(shí)間也會(huì)有很大的差異。如較低濃度時(shí),PMA是不能夠完全結(jié)合掉的死菌DNA,那么部分沒有結(jié)合的死菌的DNA便可以作為模板被擴(kuò)增出來(lái),從而造成活菌檢測(cè)數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確。如果PMA的濃度過高,PMA也可以滲入到活的細(xì)胞中,將部分活的細(xì)胞DNA結(jié)合掉,造成檢測(cè)結(jié)果的不準(zhǔn)確。因此,無(wú)論是做哪一項(xiàng)活菌檢測(cè),PMA的濃度和作用時(shí)間等參數(shù)要先優(yōu)化,后使用。PMA進(jìn)入細(xì)胞的效率和有效結(jié)合DNA的效率還與溫度有關(guān)。有研究表明。在室溫的條件下,PMA結(jié)合DNA的效率高。另外,PMA與細(xì)胞的作用時(shí)間也要考慮到位。作用時(shí)間過長(zhǎng),PMA也能夠滲透到活細(xì)胞中,造成結(jié)果的不準(zhǔn)確。

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