熒光顯微鏡常用LED激發(fā)光源特點(diǎn)
相對(duì)于一般的顯微鏡,熒光顯微鏡保留著顯微鏡功能的同時(shí),還能進(jìn)行熒光觀察,具有檢出能力強(qiáng),能進(jìn)行多重著色觀察的特點(diǎn),廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。而熒光照明光源是熒光顯微鏡的關(guān)鍵部件,作用至關(guān)重要,既要考慮檢測(cè)樣本標(biāo)記的熒光探針吸收光譜,同時(shí)又要考慮儀器的使用簡(jiǎn)便性。
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在LED前,熒光顯微鏡常用光源為高壓汞燈,在LED激發(fā)光源普遍后,就成為熒光顯微鏡的主要光源。LED發(fā)射的單色光位于相對(duì)較窄的光譜帶中,半高寬約為10nm-40nm,相對(duì)于高壓汞燈,LED激發(fā)光源有幾個(gè)重要優(yōu)勢(shì):
1)額定使用壽命可達(dá)3000小時(shí)以上,遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其他光源;
2)整個(gè)額定使用壽命期間,其輸出強(qiáng)度保持相對(duì)穩(wěn)定,確保高效激發(fā);
3)LED啟動(dòng)和關(guān)閉時(shí)間短,即開即用,不需要預(yù)熱;
4)LED光效高,且亮度連續(xù)可調(diào);
5)體積小、輕便,且為冷光源,彌補(bǔ)汞燈的大功率、發(fā)熱、使用復(fù)雜燈問題,大大的降低了熒光顯微鏡使用成本并提高熒光顯微鏡操作的簡(jiǎn)便性。
對(duì)于熒光顯微鏡來(lái)說(shuō),尤其是單色激發(fā)的熒光顯微鏡,LED具有非常大的吸引力,例如B波段激發(fā)的熒光探針FLTC/GFP標(biāo)記的樣板,在藍(lán)光LED激發(fā)下了可以獲得非常好的圖像,而廣泛應(yīng)用于免疫熒光檢測(cè)領(lǐng)域。上海峰志多波段LED顯微鏡熒光激發(fā)光源,多波段LED光源可選,并可控制每一個(gè)LED的亮度,可以實(shí)現(xiàn)多波長(zhǎng)的選擇激發(fā),便捷、高效。
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熒光顯微鏡分析中常用激發(fā)光源的種類
在熒光分析中常用汞燈作激發(fā)光源,根據(jù)汞蒸氣壓的不同可分為:
低壓汞燈
汞蒸氣,可發(fā)射出很強(qiáng)波長(zhǎng)的射線,壽命很長(zhǎng),可長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)工作,射線對(duì)眼睛有害,不眼睛時(shí)不可長(zhǎng)時(shí)間注視。
高壓汞燈
高壓汞燈又叫高強(qiáng)度紫外線燈,汞蒸氣為1-數(shù)個(gè)大氣壓,可見炮區(qū)的譜線增強(qiáng),在紫外光區(qū),波長(zhǎng)為365nm的光線zui強(qiáng)。
中壓汞燈
可以發(fā)射一系列汞線組成的不連續(xù)光譜,除254nm波長(zhǎng)以外,多數(shù)譜線都可作為校正波長(zhǎng)使用。此外,還有超高壓汞燈、汞-氙燈、汞-鋅燈等。
氫灑和氘燈
是燈泡中加氫蒸氣,經(jīng)閉合放電產(chǎn)生160-350nm波長(zhǎng)的光,氫朋激發(fā)態(tài)返回的基態(tài)時(shí),就發(fā)射了氫的連續(xù)光譜,在160nm以下為線樂譜,氫燈和氘燈性能相同,其壽命也比氫燈長(zhǎng),因玻璃吸收紫外
線,故燈殼要用石英制作,或在燈泡出光處開一石英窗,此光源適用于紫外光區(qū)的測(cè)定。
氙燈
紫外線燈的光的輻射能強(qiáng)度很高,它可在220-1100nm之間發(fā)射很強(qiáng)的連續(xù)光譜,可用于紫外區(qū),可見光及近紅外區(qū)的測(cè)定,雖其輻射范圍廣,使用中在生產(chǎn)高熱的同晨有臭氧味,其壽命短,燈泡內(nèi)壓較大,如日立牌650-60型熒光分光光度計(jì),氙燈平時(shí)約有7個(gè)大氣壓,點(diǎn)燃后可達(dá)30個(gè)大氣壓,故使用進(jìn)應(yīng)注意。
1、按裝緊固螺絲時(shí)用力應(yīng)均勻,勿成扭力,以免燈泡破裂爆炸。
2、勿用手觸及燈泡,以防受熱不均破裂。
3、如紫外線燈泡有油污,應(yīng)用雞皮藮酒精輕擦,不能用布、棉花等物擦拭。
熒光顯微鏡激發(fā)熒光的方式有哪些
熒光顯微鏡是科研、病理、檢驗(yàn)等部門常用的醫(yī)用光學(xué)儀器之一。因?yàn)槠胀ǖ娘@微鏡是在明亮的背景上觀察暗物,而熒光顯微鏡是在暗背景下觀察彩色的圖像,因此它比普通的顯微鏡分辨力提高100倍,可以觀察到普通顯微鏡看不到的細(xì)節(jié)。但是它的調(diào)整,校正難度較高,只要解決了熒光顯微鏡的問題,其它顯微鏡問題就迎刃而解。
激發(fā)光源是熒光顯微鏡主要組成部分,熒光顯微鏡都采用200W的超高壓汞燈作激發(fā)光源。它是由石英玻璃制作,中間呈球形,內(nèi)充有一定量的汞,工作時(shí)在兩極間放電,引起水銀蒸發(fā),球內(nèi)氣壓迅速升高,當(dāng)水銀完全蒸發(fā)時(shí),可達(dá)50~70個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓力,這一過程一般約5~15min。超高壓汞燈的發(fā)光是電極間放電使水銀分子在不斷解離和還原過程中發(fā)射光量子的結(jié)果。它發(fā)射很強(qiáng)的紫光,足以激發(fā)各類熒光物質(zhì),因此被熒光顯微鏡普遍采用。
熒光顯微鏡是免疫熒光組織化學(xué)的基本工具。它是由超高壓光源、濾片系統(tǒng)(包括激發(fā)和壓制濾板)、光學(xué)系統(tǒng)和攝影系統(tǒng)等主要部件組成,是利用一定波長(zhǎng)的光激發(fā)標(biāo)本發(fā)射熒光。
熒光顯微鏡激發(fā)熒光的方式:
按光的波長(zhǎng)范圍分為UV激發(fā)法(使用紫外線照明法)和BV激發(fā)法(使用藍(lán)紫光)兩種。
UV激發(fā)法是用短于400nm紫外光進(jìn)行激發(fā)。該法不存在可見的激發(fā)光,所以被觀察的熒光呈現(xiàn)該染料固有的熒光,容易判別標(biāo)本上的特異熒光和背景組織的自身熒光。
BV激發(fā)法是以404nm、434nm為中心的由紫外至藍(lán)光進(jìn)行激發(fā)。該方法使用藍(lán)光照射標(biāo)本,所以熒光顯微鏡的截止濾光片必須使用可完全阻斷藍(lán)光并可充分通過所需綠、黃熒光的濾光片。用于熒光抗體法的熒光色素。對(duì)于激發(fā)光的極大吸收波長(zhǎng)和熒光的極大發(fā)光波長(zhǎng)比較接近,所以BV激發(fā)法使用的濾光片必須使用銳截止式濾光片。該法可用藍(lán)光作為激發(fā)光,所以熒光色素的吸收效率較高,可得到較明亮的圖像。其缺點(diǎn)是500nm以下的熒光無(wú)法看到,而500nm以上的使整個(gè)圖像顯黃色。在熒光抗體法中,大多以熒光色素特有的顏色來(lái)判斷其特異性,所以在討論微妙的特異性時(shí),上述BV激發(fā)法的缺點(diǎn)往往影響極大。
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