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PCR的基本原理和操作步驟

作者:上海峰志 時(shí)間:2021-03-23 15:46:58瀏覽14300 次

信息摘要:

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction),簡(jiǎn)稱PCR,是一種分子生物學(xué)技術(shù),用于放大特定的DNA片段??煽醋魃矬w外的特殊DNA復(fù)制。PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程,其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。

PCR的基本原理和操作步驟

普通PCR概述
 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction),簡(jiǎn)稱PCR,是一種分子生物學(xué)技術(shù),用于放大特定的DNA片段??煽醋魃矬w外的特殊DNA復(fù)制。DNA聚合酶(DNA polymerase I)zui早于1955年發(fā)現(xiàn),而較具有實(shí)驗(yàn)價(jià)值及實(shí)用性的Klenow fragment of E.  Coli 則是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所發(fā)現(xiàn),但由于此酶不耐高溫,高溫能使之變性, 因此不符合使用高溫變性的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)?,F(xiàn)今所使用的酶(簡(jiǎn)稱Taq polymerase), 則是于1976年從溫泉中的細(xì)菌(Thermus aquaticus)分離出來(lái)的。它的特性就在于能耐高溫,是一個(gè)很理想的酶,但它被廣泛運(yùn)用則于80年代之后。

PCRzui初的原始雛形概念是類似基因修復(fù)復(fù)制,它是于1971年由 Dr. Kjell Kleppe 提出。他發(fā)表了個(gè)單純且短暫性基因復(fù)制(類似PCR前兩個(gè)周期反應(yīng))的實(shí)驗(yàn)。而現(xiàn)今所發(fā)展出來(lái)的PCR則于1983由 Dr. Kary B. Mullis發(fā)展出的,Dr. Mullis當(dāng)年服務(wù)于PE公司,因此PE公司在PCR界有著特殊的地位。Dr.  Mullis 并于1985年與Saiki 等人正式發(fā)表了篇相關(guān)的論文。此后,PCR的運(yùn)用一日千里,相關(guān)的論文發(fā)表質(zhì)量可以說(shuō)是令眾多其它研究方法難望其項(xiàng)背。隨后PCR技術(shù)在生物科研和臨床應(yīng)用中得以廣泛應(yīng)用,成為分子生物學(xué)研究的zui重要技術(shù)。Mullis也因此獲得了1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。 

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2 PCR原理
PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程,其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成:
①模板DNA的變性:模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后,使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結(jié)合,為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備;
②模板DNA與引物的退火(復(fù)性):模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合;
③引物的延伸:DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP為反應(yīng)原料,靶序列為模板,按堿基互補(bǔ)配對(duì)與半保留復(fù)制原理,合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈,重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過(guò)程就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”,而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2~4分鐘,2~3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。

3 PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件 

3.1標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系

10×擴(kuò)增緩沖液 10μl
4種dNTP混合物 200μl
引物 10~100μl
模板DNA 0.1~2μg
Taq DNA聚合酶 2.5 μl
Mg2+ 1.5mmol/L
加雙或三蒸水 100 μl

3.2 PCR反應(yīng)五要素

參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物(PCR引物為DNA片段,細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的引物為一段RNA鏈)、酶、dNTP、模板和緩沖液(其中需要Mg2+)。[PCR步驟]

  標(biāo)準(zhǔn)的PCR過(guò)程分為三步:
 1.DNA變性(90℃-96℃):雙鏈DNA模板在熱作用下, 氫鍵斷裂,形成單鏈DNA
 2.退火(25℃-65℃):系統(tǒng)溫度降低,引物與DNA模板結(jié)合,形成局部雙鏈。
 3.延伸(70℃-75℃):在Taq酶(在72℃左右,活性zui佳)的作用下,以dNTP為原料,從引物的5′端→3′端延伸,合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。
 每一循環(huán)經(jīng)過(guò)變性、退火和延伸,DNA含量即增加一倍。現(xiàn)在有些PCR因?yàn)閿U(kuò)增區(qū)很短,即使Taq酶活性不是zui佳也能在很短的時(shí)間內(nèi)復(fù)制完成,因此可以改為兩步法,即退火和延伸同時(shí)在60℃-65℃間進(jìn)行,以減少一次升降溫過(guò)程,提高了反應(yīng)速度。 

4 PCR反應(yīng)特點(diǎn) 

4.1特異性強(qiáng)   PCR反應(yīng)的特異性決定因素為:
 ①引物與模板DNA特異正確的結(jié)合;
 ②堿基配對(duì)原則;
 ③Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性;
 ④靶基因的特異性與保守性。

其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對(duì)原則的。聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性及Taq DNA聚合酶耐高溫性,使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合(復(fù)性)可以在較高的溫度下進(jìn)行,結(jié)合的特異性大大增加,被擴(kuò)增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過(guò)選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū),其特異性程度就更高。 


 4.2 靈敏度高
 PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的,能將皮克(pg=10-12)量級(jí)的起始待測(cè)模板擴(kuò)增到微克(μg=-6)水平。能從100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞;在病毒的檢測(cè)中,PCR的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU(空斑形成單位);在細(xì)菌學(xué)中zui小檢出率為3個(gè)細(xì)菌。 
  

4.3簡(jiǎn)便、快速
 PCR反應(yīng)用耐高溫的Taq DNA聚合酶,一次性地將反應(yīng)液加好后,即在DNA擴(kuò)增液和水浴鍋上進(jìn)行變性-退火-延伸反應(yīng),一般在2~4 小時(shí)完成擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析,不一定要用同位素,無(wú)放射性污染、易推廣。
 

4.4 對(duì)標(biāo)本的純度要求低
 不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞,DNA 粗制品及RNA均可作為擴(kuò)增模板??芍苯佑门R床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等DNA擴(kuò)增檢測(cè)。 

PCR常見(jiàn)問(wèn)題 

5.1假陰性,不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶
 PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有:
①模板核酸的制備,
②引物的質(zhì)量與特異性,
③酶的質(zhì)量及,  
④PCR循環(huán)條件。

尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。
 模板:
①模板中含有雜蛋白質(zhì),
②模板中含有Taq酶抑制劑,
③模板中蛋白質(zhì)沒(méi)有消 化除凈,特別是染色體中的組蛋白,
④在提取制備模板時(shí)丟失過(guò)多,或吸入酚。
⑤模 板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí),不出現(xiàn)擴(kuò)增帶,極有可能是標(biāo)本的消化處  理,模板核酸提取過(guò)程出了毛病,因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液,其程序亦應(yīng) 固定不宜隨意更改。
 酶失活:需更換新酶,或新舊兩種酶同時(shí)使用,以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或溴乙錠。
 引物:引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱,是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見(jiàn)原因。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問(wèn)題,兩條引物一條濃度  高,一條濃度低,造成低效率的不對(duì)稱擴(kuò)增,對(duì)策為:
①選定一個(gè)好的引物合成單 位。
②引物的濃度不僅要看OD值,更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳,一定要有引物條帶出現(xiàn),而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致,如一條引物有條帶,一條引物無(wú)條帶,此時(shí)做PCR有可能失敗,應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高,一條亮度低,在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。
③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存,防止多次凍融或長(zhǎng)期放冰箱冷藏部分,導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。
④引物設(shè)計(jì)不合理,如引物長(zhǎng)度不夠,引物之間形成二聚體等。
 Mg2+濃度:Mg2+離子濃度對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響很大,濃度過(guò)高可降低PCR擴(kuò)增的特異性,濃度過(guò)低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。
 反應(yīng)體積的改變:通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul、30ul、50ul?;?00ul,應(yīng)用多大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增,是根據(jù)科研和臨床檢測(cè)不同目的而設(shè)定,在做小體積如20ul  后,再做大體積時(shí),一定要模索條件,否則容易失敗。
 物理原因:變性對(duì)PCR擴(kuò)增來(lái)說(shuō)相當(dāng)重要,如變性溫度低,變性時(shí)間短,極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過(guò)低,可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過(guò)高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì),檢測(cè)一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度,這也是PCR失敗的原因之一。
 靶序列變異:如靶序列發(fā)生突變或缺失,影響引物與模板特異性結(jié)合,或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列,其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。
 

5.2 假陽(yáng)性
 出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致,有時(shí)其條帶更整齊,亮度更高。
 引物設(shè)計(jì)不合適:選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性,因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí),擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。需重新設(shè)計(jì)引物。
 靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染:這種污染有兩種原因:一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染,導(dǎo)致假陽(yáng)性。這種假陽(yáng)性可用以下方法解決:操作時(shí)應(yīng)小心輕柔,防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外,試劑或器材均應(yīng)高壓。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時(shí),在加標(biāo)本前,反應(yīng)管和試劑用紫外線照射,以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染,這些小片段比靶序列短,但有一定的同源性??苫ハ嗥唇?,與引物互補(bǔ)后,可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物,而導(dǎo)致假陽(yáng)性的產(chǎn)生,可用巢式PCR方法來(lái)減輕或消除。
 

5.3 出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶
 PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致,或大或小,或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶 與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn),其原因:一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、  或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過(guò)高、退火溫度過(guò)低,及PCR循環(huán)次數(shù)  過(guò)多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量,往往一些來(lái)源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來(lái)源的酶 則不出現(xiàn),酶量過(guò)多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對(duì)策有:必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引 物。減低酶量或調(diào)換另一來(lái)源的酶。降低引物量,適當(dāng)增加模板量,減少循環(huán)次  數(shù)。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法(93℃變性,65℃左右退火與延伸)。
 

5.4出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶
 PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過(guò)多或酶的質(zhì)量 差,dNTP濃度過(guò)高,Mg2+濃度過(guò)高,退火溫度過(guò)低,循環(huán)次數(shù)過(guò)多引起。其對(duì)策有:減少酶量,或調(diào)換另一來(lái)源的酶。②減少dNTP的濃度。適當(dāng)降低Mg2+濃  度。增加模板量,減少循環(huán)次數(shù)。


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