熒光蛋白激發(fā)光源用于棉花功能基因篩選

河南大學研究人員將LUYOR-3415RG熒光蛋白激發(fā)光源用于棉花功能基因篩選和視覺標記

2022年初，河南大學在《Front Plant Sci.》期刊發(fā)表文獻《Optimizing the Protein Fluorescence Reporting System for Somatic Embryogenesis Regeneration Screening and Visual Labeling of Functional Genes in Cotton》，文獻中指出利用LUYOR-3415熒光蛋白激發(fā)光源能夠棉花基因的篩選?！　?/p>

蛋白質(zhì)熒光報告系統(tǒng)對于深入的生命科學研究至關重要，為體內(nèi)微觀生物活性的可視化提供了系統(tǒng)的標記工具，并徹底改變了基礎研究。棉花體細胞再生效率低，造成棉花轉(zhuǎn)化困難。有利于利用熒光報告系統(tǒng)篩選轉(zhuǎn)基因體細胞胚胎。　　

然而，目前棉花中可用的熒光標記系統(tǒng)有限。為了優(yōu)化棉花的熒光報告系統(tǒng)，擴大可用熒光蛋白的范圍，河南大學棉花實驗室選擇了11種熒光蛋白，涵蓋紅色、綠色、黃色和青色熒光顏色，并用棉花表達。除mRuby2和G3GFP外，其他9種熒光蛋白(mCherry，tdTomato，sfGFP，Clover，EYFP，YPet，mVenus，mCerulean和ECFP)在轉(zhuǎn)基因愈傷組織和胚胎中穩(wěn)定而強烈地表達，并在來自不同的棉花器官中遺傳自篩選的胚胎?！　?br/>

此外，表達tdTomato的轉(zhuǎn)基因棉花在白光下呈粉紅色，不僅對愈傷組織、胚胎組織，而且對成熟植物的各種器官也呈粉紅色，為棉花遺傳轉(zhuǎn)化過程提供了視覺標記，加速了轉(zhuǎn)基因事件的評價。河南大學棉花實驗室在體內(nèi)構建了表達mCherry標記的轉(zhuǎn)基因棉花細胞器標記物，覆蓋了七個特定的亞細胞區(qū)室：質(zhì)膜，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，土著體，線粒體，質(zhì)體，高爾基體和過氧化物酶體。河南大學棉花實驗室還提供了一種簡單而的策略，使用細胞器標記物快速確定棉細胞中未表征蛋白質(zhì)的亞細胞定位?！　?br/>

然后，河南大學棉花實驗室建立了個使用氣孔特異性表達啟動子(ProKST1，ProGbSLSP和ProGC1)的棉花氣孔熒光報告系統(tǒng)來驅(qū)動三葉草表達。本研究中用于轉(zhuǎn)基因體細胞胚胎篩選和功能基因標記的優(yōu)化熒光標記系統(tǒng)為加速體細胞再生效率和體內(nèi)監(jiān)測棉花中各種細胞過程提供了潛力?！　?br/>

用變焦立體顯微鏡觀察轉(zhuǎn)基因棉花或煙草表皮細胞的胚胎愈傷組織，雄蕊，雌蕊，葉和種子組織中的熒光(奧林巴斯，東京，日本)。用共聚焦電子顯微鏡觀察轉(zhuǎn)基因棉花原生質(zhì)體，氣孔細胞，纖維，葉表皮細胞和根部樣品中的熒光(尼康，東京，日本)。大于 2 厘米的轉(zhuǎn)基因樣品2使用LUYOR-3415RG手持熒光燈(中國上海LUYOR)進行觀察，并使用EOS 800D相機(佳能，中國北京)拍攝圖像，并帶有LUV-495A和LUV-590A熒光拍照濾鏡(LUYOR)，用于綠色和紅色熒光觀察。使用濾光片。　　

該研究證實，LUYOR-3415RG便攜式熒光蛋白激發(fā)光源能夠觀察GFP、eGFP、dsred、Mcherry、Tdtomato等綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白的表達。

FIGURE 1 Stable expression of red and green fluorescent proteins (RFPs and GFPs, respectively) in cotton callus and embryo tissues. The protoplast of transgenic callus expression empty vector, RFP (A) and GFP (B) under white light (bright) and excitation light (fluorescence); scale bar, 20 μm. The transgenic embryo expression empty vector, RFP (C), and GFP (D) under white light (bright) and excitation light (fluorescence); scale bar, 1 mm. RFPs: mRuby2, mCherry and tdTomato; GFPs: G3GFP, sfGFP and Clover.

FIGURE 2 Red fluorescent protein (RFP) fluorescence in different tissues/organs of transgenic regenerated T0 plants. (A) Transgenic cotton plants expressing RFP during vegetative growth showed red fluorescence in their whole aerial portions under excitation spectra; scale bar, 2 cm. (B–E) The root (scale bar, 100 μm), fiber (scale bar, 50 μm), stamen/pistil (scale bar, 2 mm), and seed (scale bar, 1 mm) of transgenic regenerated cotton plants expressing empty vector and RFP under white light (bright) and excitation light (fluorescence).

FIGURE 3 Green fluorescent protein (GFP) fluorescence in different tissues/organs of transgenic regenerated T0 plants. (A) Observation of green fluorescence under excitation spectra in aerial parts of transgenic cotton plants during vegetative growth stage; scale bar, 2 cm. (B–E) The root, fiber, stamen/pistil, and seed tissues of transgenic regenerated cotton plants under white light (bright) and excitation light (fluorescence). Scale bars (white) are defined in images. (F) Measurement of GFP in young and old leaf of transgenic cotton expressing Clover by western blot.

文獻全文下載地址：https://doi.org/10.3389/fpls.2021.825212  

河南大學棉花生物學重點實驗室

棉花生物學重點實驗室于2011年10月批準成立，依托單位為河南大學和中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所。2014年1月通過建設期驗收。2017年6月通過科技部輪五年評估，評估結果為“良好”?，F(xiàn)有固定人員30人，包括杰青1人，百千萬人才工程入選者3人、國務院特殊津貼獲得者3人，中科院百人計劃專家1人，中原學者1人，中原-基礎研究領軍人才1人，河南省專家3人，河南大學“杰出人才特區(qū)支持計劃”及攀登計劃等校級特聘教授12人。在研自然科學基金重點項目、重點研發(fā)計劃等科研27項，科研經(jīng)費3264.4萬元。 2019年發(fā)表SCI論文51篇，申請專利4項。

實驗室主要圍繞棉花生物學重大科學問題開展基礎和應用基礎研究工作，為棉花基礎創(chuàng)新提供源動力，為棉花重大前沿問題的解決提供支撐，為棉花高層次科研人才培養(yǎng)和交流提供平臺。主要研究方向包括：一、棉花基因組學及遺傳多樣性研究；二、棉花品質(zhì)生物學及功能基因研究；三、棉花產(chǎn)量生物學及遺傳改良研究；四、棉花逆境生物學及環(huán)境調(diào)控研究。

實驗室擁有“作物光高效利用及耐逆多基因聚合分子設計育種”河南省科技創(chuàng)新團隊，“農(nóng)業(yè)昆蟲與害蟲防治”和“水分脅迫與植物次生代謝調(diào)控”兩個河南省高?？萍紕?chuàng)新團隊。

擁有引智平臺1個（作物逆境生物學創(chuàng)新引智基地，“111計劃”）、省級引智平臺1個（河南省植物逆境多組學創(chuàng)新引智基地）和省級聯(lián)合實驗室1個（河南省作物逆境多組學聯(lián)合實驗室）和“河南大學-亞伯大學多組學創(chuàng)新基地“，兼職工作的外籍專家包括美國科學院院士Alexander S. Raikhel教授等20余位學術大師和學術骨干。